Il d-ROMs test è un test spettrofotometrico che consente di determinare, in un campione biologico, la concentrazione degli idroperossidi (ROOH), generati nelle cellule dall’attacco ossidativo dei ROS su svariati substrati biochimici (glicidi, lipidi, amminoacidi, proteine, nucleotidi ecc.).
La sigla ROM vuole sottolineare che gli analiti
misurati dal test, gli idroperossidi, sono dei
metaboliti reattivi dell’ossigeno (Reactive Oxygen
Metabolites, ROM).
Attraverso il d-ROMs test gli idroperossidi di un
campione biologico, quale, ad esempio, il siero,
dopo aver reagito con un apposito cromogeno
sviluppano un derivato colorato (dal rosa al rosso) rilevabile e quantificabile per via spettrofotometrica.
La concentrazione degli idroperossidi, che
correla direttamente con l’intensità del colore
rilevato, viene espressa in unità di concentrazione
di facile impiego nella pratica clinica.
Tali unità sono indicate con la sigla U CARR dal cognome dell' inventore Mauro Carratelli (dove 1 U CARR equivale a 0.08 mg H2O2/dL), a causa dell’eterogeneità delle specie chimiche presenti inizialmente nel campione biologico da testare.
Il principio alla base del d-ROMs test è quello del la reazione di Fenton,
verificato per il perossido di idrogeno e
successivamente ampliato da Haber e Weiss,
secondo cui un metallo di transizione in forma
ionica (es. ferro o rame) catalizza la scissione di un idroperossido (ROOH), generando nuove specie
radicaliche, l’idroperossile (ROO*) o l’alcossile
(RO*), a seconda che, rispettivamente, lo ione
catalizzante si ossidi (Fe2+-> Fe3+o Cu+ -> Cu2+)
oppure si riduca.
Nel d-ROMs test, dunque, gli idroperossidi
contenuti in un campione biologico – per comodità
espositiva, nel siero – vengono messi nelle
condizioni previste dalla reazione di Fenton per
generare in vitro radicali idroperossilici ed
alcossilici.
1A) R-OOH + Fe2+ -> R-O* + Fe3++ OH-
1B) R-O* + A-NH2 -> R-O- + [A-NH2*]+
2A) R-OOH + Fe3+-> R-OO* + Fe2+ (Cu+) + H+
2B) R-OO* + A-NH2 -> R-OO- + [A-NH2*]+
Il d-ROMs test può essere eseguito sia in cinetica che in endpoint. In ambedue i casi, prima di procedere all’esecuzione dell’analisi, bisogna preparare lo standard (o calibratore), fornito all' interno del kit sotto forma di siero liofilo a matrice umana a titolo noto (U CARR), indicato sull’etichetta.
Nella procedura cinetica standard si parte
preparando tre soluzioni: il bianco reagente, il
campione (preferibilmente siero fresco) ed il
calibratore. Tali soluzioni vanno incubate per 1 minuto a 37 °C, quindi, terminata l’incubazione, esse vanno
sottoposte a lettura fotometrica, misurando
l’assorbanza a 505 nm (A505) o 546 nm (A505)
immediatamente e successivamente, nelle stesse
condizioni di lavoro (37°C), dopo 1, 2 e 3 min. Ai
valori di assorbanza ottenuti per il campione e per il
calibratore si sottrae, quindi, il valore di assorbanza
del bianco reagente.
Nella procedura endpoint si parte preparando tre soluzioni: il bianco reagente, il campione (siero o plasma eparinato) ed il calibratore. Le soluzioni vanno lasciate ad incubare a 37°C per 75 minuti. Appena terminata l’incubazione, vanno sottoposte a lettura fotometrica, misurando l’assorbanza a 505 nm o 546 nm. Ai valori di assorbanza ottenuti per il campione e per il calibratore si sottrae, quindi, il valore di assorbanza del bianco reagente (azzeramento con bianco reagente).
Tali metodi permettono quindi di applicare il d-ROMs Test sia a fotometri e spettrofotometri manuali (o al FREE System, sistema dedicato allo studio dello stress ossidativo, che ha kit appositi preinfialati), a lettori di micropiatre o ad analizzatori automatici, venendo quindi incontro a tutte le esigenze dei professionisti della diagnosi.
La disponibilità di una metodica precisa ed
affidabile ha consentito di stabilire i livelli ematici di
riferimento del d-ROMs nella popolazione normale.
Si è potuto dimostrare, su un campione di circa
5.000 soggetti clinicamente sani, che il livello di
idroperossidi circolanti determinati con il d-ROMs
test segue nella popolazione una distribuzione
unimodale con un picco tra 250 e
300 U CARR (pari a 20.08-24.00 mg/dL di H2O2),
individuato come il valore di riferimento del test.
Tuttavia, i neonati presentano
valori sensibilmente più bassi, le gravide più alti. E’ consigliabile,
comunque, che ogni laboratorio determini i propri valori di riferimento.
Valori superiori a 300 U CARR configurano, dopo una fascia borderline
(301 - 320 U CARR), livelli progressivamente crescenti di stress
ossidativo, come indicato in tabella:
Si è anche osservato che i risultati del d-ROMs
test non sono significativamente influenzati né dal
sesso né dall’età, tuttavia, i neonati presentano
valori sensibilmente più bassi, le gravide più alti.
Inoltre, i risultati del d-ROMs test eseguito
ripetutamente nello stesso soggetto nell’arco della
giornata non mostrano differenze degne di nota, a
meno che non intervengano fattori in grado di
indurre una brusca produzione di perossidi (es. uno
sforzo muscolare intenso).
E’ consigliabile,
comunque, che ogni laboratorio determini i propri valori di riferimento.
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