I tioli rappresentano una componente qualitativamente significativa della barriera antiossidante plasmatica.
Infatti, i gruppi sulfidrilici delle molecole dei componenti plasmatici (quali, ad esempio, le proteine, P-SH) possono opporsi alla fase di propagazione dei processi perossidativi inattivando i radicali sia alcossilici (RO•) che idrossilici (HO•), rispettivamente, secondo le reazioni:
2 P-SH + 2 RO• -> 2 PS• + 2 ROH -> P-S-S-P + 2 ROH
2 P-SH + 2 HO• -> 2 PS• + 2 H2O -> P-S-S-P + 2 H2O
In pratica, considerando l’evento dal punto di vista stechiometrico, una coppia di gruppi tiolici può ossidare una coppia di radicali alcossililici (RO•) o idrossilici (HO•), cedendo ad essa due elettroni (sotto forma di due atomi di idrogeno). In questo modo ambedue i tipi di radicali vengono inattivati: i radicali alcossilici sono rilasciati come molecole di alcool mentre i radicali idrossilici diventano innocue molecole d’acqua. I gruppi tiolici ormai ossidati, invece, reagiscono tra loro, generando ponti disolfuro.
Va ricordato, in tale contesto, che i gruppi sulfidrilici ossidandosi contrastano l’attacco di alcuni radicali liberi istolesivi, ma, quando si formano nel contesto di molecole proteiche, possono avere conseguenze indesiderate. Per esempio la formazione di un ponte disolfuro fra i residui di cisteina di due diverse proteine può portare ad una sorta di “polimerizzazione”. Se il ponte disolfuro, invece, si crea nell’ambito della stessa catena, la proteina può modificare stabilmente la sua conformazione. In ambedue i casi è possibile che le proteine coinvolte nella formazione di legami –S–S– subiscano un’alterazione delle proprie capacità funzionali.
L’ –SHp test si basa sulla capacità dei gruppi –SH di sviluppare un complesso colorato determinabile fotometricamente (picco di massima assorbanza, 405 nm) quando reagiscono con l’acido 5,5-ditiobis-2-nitrobenzoico (DTNB) secondo il metodo inizialmente proposto da Ellman nel 1959 e poi adattato da Carratelli (41). Il “titolo” di tioli è direttamente proporzionale all’intensità del colore rilevato strumentalmente.
Il test ha mostrato un grado accettabile di imprecisione analitica. Infatti, il CV intraserie su 20 aliquote di siero fresco è stato pari a 1.7%, quello interserie su 20 aliquote di siero congelato 3.3% (41).
L’ –SHp test va eseguito su siero o plasma freschi nelle seguenti condizioni di lavoro: lunghezza d’onda 405 nm, cammino ottico 1 cm, temperatura ambiente. Si può eseguire l’analisi solo con la modalità end point.
Prima di procedere all’esecuzione del test bisogna preparare anzitutto lo standard, fornito col kit sotto forma di siero liofilo a matrice umana a titolo noto, indicato sull’etichetta.
A questo scopo è sufficiente aggiungere al liofilizzato il volume di acqua distillata previsto (indicato dal produttore) e mescolare la soluzione così ottenuta con delicatezza, avendo cura di attenersi alle indicazioni di carattere generale descritte in dettaglio a proposito del d-ROMs test.
Dopo aver portato i reagenti alla temperatura di lavoro, si prepara, quindi, la soluzione del calibratore per i gruppi tiolici (L-cisteina). In pratica si scioglie la L-cisteina in polvere (R3) in 25 mL di acqua distillata e si prepara da essa, per diluizione, una soluzione 496 mM di gruppi tiolici. Tale soluzione è stabile per 2-3 ore e 2-3 giorni, a temperatura ambiente o +4°C, rispettivamente. A questo punto avendo pronti lo standard di siero e il calibratore “chimico”, si preparano cinque soluzioni.
Le soluzioni così preparate vanno mescolate delicatamente e lasciate ad incubare a temperatura ambiente per 3-4 minuti. Terminata l’incubazione, esse vanno sottoposte a lettura fotometrica, misurando l’assorbanza a 405 nm.
I risultati del test, ovvero la capacità antiossidante o titolo tiolico del campione analizzato, saranno espressi in µmoli di –SH/L di campione.
Il range negli individui normali è 450–650 µmoli/L. Una riduzione dei valori del test al di sotto di questo intervallo si correla direttamente con una ridotta efficienza della barriera antiossidante tiolica. In ogni caso è consigliabile che ciascun laboratorio determini i propri valori di riferimento.
Il titolo dei tioli, determinato mediante l’–SHp test, è risultato più basso rispetto ai controlli nella sindrome di Down, ove anche l’ OXY-Adsorbent fornisce valori inferiori alla norma, contro il palese incremento del d-ROMs test.
E’ interessante sottolineare che in pazienti Down l’integrazione con acido α-lipoico è risultata in grado di far tornare nel range della normalità valori di –SHp test precedentemente bassi.
Una situazione di squilibrio del bilancio redox simile a quella dei Down è stata osservata anche nelle sindromi mielodisplastiche.
In generale, l’–SHp test si è dimostrato molto affidabile nella valutazione della componente tiolica della barriera antiossidante plasmatica in diversi studi clinici, integrando egregiamente i risultati dell’OXY-Adsorbent test e del d-ROMs test nella valutazione globale dello stress ossidativo, in particolare nei fumatori, nei nefro-trapiantati, nei dializzati, negli uremici e nel monitoraggio dell’efficacia dell’integrazione alimentare dei pazienti cancerosi. Interessanti anche i risultati in medicina veterinaria, su bovini.
L’ –SHp test, infine, trova particolare indicazione quando vi è ragionevole sospetto di una situazione di stress ossidativo ed i valori del
d-ROMs test risultano bassi. Una situazione del genere può riscontrarsi, per esempio, in soggetti con neoplasie solide. In queste condizioni, il viraggio del metabolismo cellulare in senso anaerobio genera la produzione, nell’intorno della massa tumorale, di cataboliti acidi. Questi ultimi, riducendo localmente il pH possono favorire il rilascio di ferro che catalizza la formazione del radicale alcossile dagli idroperossidi circolanti. I gruppi tiolici, a questo punto, possono reagire con i radicali alcossilici prodotti riducendo, di fatto, il livello di idroperossidi circolanti. In questa condizione il d-ROMs test darà valori bassi non perché non vengano prodotti idroperossidi, ma perché essi vengono neutralizzati dai gruppi sulfidrilici. Solo il riscontro di una riduzione concomitante dei gruppi tiolici consentirà di interpretare questo singolare quadro di laboratorio.
DIACRON INTERNATIONAL s. r. l. è un’azienda certificata ISO 9001:2000
